ELISA实验指南（3）之直接ELISA法

直接ELISA法

       直接ELISA可视为ELISA最简单的形式，如图1和下图所示。

Fig. 1.  Direct ELISA. Antigen is attached to the solid phase by passive adsorption.After washing, enzyme-labeled antibodies are added. After an incubation period and washing, a substrate system is added and color is allowed to develop.

       抗原被稀释在缓冲液(第i阶段)中，通常是高pH ( 9.6 )的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液或中性磷酸盐缓冲液( PBS )中，关键是缓冲液中不含有其他可能与目的抗原竞争的蛋白质，以附着在塑料固相上。抗原在自然界中主要是蛋白质，在孵育一段时间内会被动地附着在塑料上。孵化的温度和时间并不那么关键，但条件的标准化至关重要，37℃的孵化器的使用受到青睐(因为它们在实验室中广泛可用)。孵育结束后，用简单的洗涤步骤(第ii阶段)，用中性缓冲溶液(如PBS )，通过灌满和扣干酶标孔等步骤去除任何过量抗原。现在可以加入与酶偶联的抗体(第iii阶段)，在固相阻断结合试剂中特异性结合抗原位点。即将偶联的抗体稀释在含有某种抑制蛋白质被动吸附的物质的缓冲液中，但仍允许免疫结合。这类物质要么是其他蛋白，它们是在高浓度下加入，以与抗体蛋白竞争固相位点，要么是低浓度下的洗涤剂，称为阻断剂，及其相关试剂配置的缓冲液，称为阻断缓冲液。

       孵育时，抗体与抗原结合。再次，用简单的洗涤步骤去除未结合抗体(阶段iv )。阶段v是为附着在抗体上的特定酶添加合适的底物或底物/色原组合。目的是允许通过酶催化作用发生显色反应。反应允许在一定的时间内进行，此后通过改变体系的pH，或者加入抑制反应物，使反应停止(阶段vi )。最后，利用分光光度计在合适的波长下读数(阶段vii )对颜色进行定量。

       直接法这类体系在仅以这种形式使用时具有严重的局限性，但在竞争和抑制试验中已经作为‘靶’系统承担了很重要的功能，特别是当单抗具有共轭性或Highly Defined Antigens被使用时。

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