ELISA实验指南（19）之ELISA的各个阶段详解（二）

1. 固相酶联免疫孔板抗原的包被

      固相酶联免疫吸附试验的一个关键特点是，抗原或抗体可以通过被动吸附很容易地附着在表面上。 这个过程通常称为包被。 大多数蛋白质吸附在塑料表面，可能是由于非极性蛋白质亚结构和塑料基质之间的疏水相互作用的结果。 这种相互作用与蛋白质的净电荷无关，因此每一种蛋白质都有不同的结合常数。 塑料/蛋白质相互作用的疏水性可以用来增加结合，因为大多数蛋白质的亲水残基位于外部，而大多数疏水残基朝向内部。 

      某些蛋白质的部分变性导致疏水区域的暴露，并确保与塑料更牢固的相互作用。 这可以通过将蛋白质暴露在低pH值或温和的洗涤剂中，然后在涂层前对涂层缓冲液进行透析来实现。包被的速率和程度取决于这些因素:

      A.  附着分子的扩散系数。 

      B.  被包被的表面积与包被溶液的体积之比。  

      C. 被吸附物质的浓度。 

      D.  温度。 

      E.  吸附时间。

Fig. 1. Effects on antibodies of coating. (A) Antibody molecules packed evenly, orientation of Fc on plate,monovalent interaction of multivalent Ag; (B) antibody molecules packed evenly, orientation Fc and Fab on plate, monovalent binding of multivalent Ag; (C) antibody binding in all orientations,monovalent binding of multivalent Ag; (D) antibody binding via Fab, no binding of Ag; (E) antibody spaced with orientation to allow bivalent interaction between adjacent antibody molecules;(F) antibody spaced too widely to allow adjacent molecules to bind bivalently via Fc; (G) as in (E) except that orientation is via Fc or Fab; (H) more extreme case of (C) with less antibody and more molecules inactive owing to orientation; (I) multilayered binding in excess leading to binding but elution on washing.Orientation and concentration of antibody molecules must also be considered because these factors affect the activity of assays. Figures 1 and 2 examine the elements of adsorption.

      这些因素是相互关联的。 用合适的滴定法确定每个体系中包被的最佳抗原浓度是最重要的。 蛋白质的浓度范围为1-10µg/mL，体积为50µL，可以很好地指导塑料微孔板上饱和可用位点所需的蛋白质水平。 当相对纯抗原(除免疫分析的目标外不含其他蛋白质)可用时，这是可靠的。 因此，浓度可能与活性有关。 然而，当包被溶液含有相对少量所需抗原时，附着在孔上的量根据其在混合物中的比例减少。 其他受污染的蛋白质会占据塑料孔板上的某些部位。 由于塑料具有有限的饱和水平，使用相对粗糙的抗原涂层可能会导致不良的检测结果。  

      在评估不同浓度的结合蛋白的效果时必须小心，因为结合的实际密度可能会影响结果。 抗原的高密度结合可能不允许抗体通过空间位阻结合(抗原分子太密集)。 高浓度的抗原也可能增加堆积或分层，这可能导致后续试剂的相互作用不太稳定。 

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