ELISA实验指南（20）之ELISA的各个阶段详解（三） ​

      上一篇文章讲到固相酶联免疫孔板包被的原理及一些影响包被效果的客观因素。接下来我们讲讲具体包被过程中影响包被的一些条件。

      1. 包被时间和温度

      疏水相互作用的速率取决于温度:温度越高，疏水相互作用的速率越大。 孵化条件有很多变化。 必须记住，所有的因素都会影响包被，因此，与低浓度的抗原相比，高浓度的蛋白质可使孵育时间较短。 最常见的条件包括37℃孵育1-3h或4℃过夜，或两者结合，或室温孵育(更模糊)1-3h(典型研究见参考文献2)。 还有更多的变化，最终，每个科学家必须滴定特定的抗原，以获得特定抗原的标准体系。升高温度可能会对包被阶段的抗原产生有害影响，这可能是选择性的，因此混合物中的某些抗原会受到影响，而其他抗原则不会。 通过增加包被分子与塑料之间的接触速率，旋转板材可以大大减少包被所需的时间。  

Fig.2. Possible effects on soluble protein of immobilization. Protein is shown as having three antigenic sites (epitopes). Two are linear (solid box and shaded pentagon), and one is conformational dependent (shaded oval).(A) (i) to (iii) The orientation of the molecule on the well affects the presentation of the individual epitopes. This is true of passive and covalent binding to plastic. (B) Aggregation of the antigen can complicate presentation and also lead to leaching following binding with detecting antibody. (C) The antigen may be altered through treatment before attachment. In both (i) and (ii) the conformational epitope has been destroyed. Note also that the orientation of the molecules affects the presentation and spacing between individual epitopes. (D) Nondenatured protein can also alter its conformation by passive adsorption to plastic.

      2. 包被缓冲液  

      最常用的包被缓冲液是50mM的碳酸盐，pH值9.6; 20mM Tris-HCl, pH 8.5; 和10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)， pH 7.2(2)。 在分析开发初期遇到问题或比较问题时，应研究不同的包被缓冲液。 从理论的角度来看，最好使用比所附蛋白质等电点(pI)值高1到2个单位的缓冲液。 这在实际操作中不容易确定，因为抗原通常是蛋白质的复杂混合物。 通过直接研究不同ph值和离子强度的影响，可以观察到更大的蛋白质结合。 研究发现，0.6M NaCl的离子强度与最佳pH结合，可以更好地吸附各种单纯疱疹病毒肽(3)。含有许多酸性蛋白的蛋白质可能需要较低的pH来中和蛋白质和固相之间的斥力，如文献3所示，其中肽的最佳包被pH为2.5-4.6。 pH为7.4的PBS也适用于包衣多种抗原。含有许多酸性蛋白的蛋白质可能需要较低的pH来中和蛋白质和固相之间的斥力，如文献3所示，其中肽的最佳包被pH为2.5-4.6。 pH为7.4的PBS也适用于包衣多种抗原。 通过在37℃下使用挥发性缓冲液(碳酸铵)和PBS中干燥底片的涂层通常是成功的，特别是当有相对粗糙的样品时。特别是在有相对粗的样品时。有些抗原会带来特殊的问题，包括一些多糖、脂多糖和糖脂。在证明不可能直接用试剂包被孔板的情况下，可能需要用特异性抗血清对孔板进行初步包被。因此，必须建立夹心(诱捕)条件。被动吸附有几个理论上的缺点，虽然不一定是实际的。其中包括脱附、结合能力和非特异性结合。

      3. 解吸  

      由于塑料/蛋白质相互作用的非共价性质，解吸(浸出)可能在试验阶段发生。 然而，如果条件标准化，浸出不会影响大多数试验的可行性。 有一些报告指出，在测定的各个阶段(包括包被后)的水洗强度通过蛋白质剥离影响测定; 然而，我还没有遇到过这个问题。

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